实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·
实时荧光定量 PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在 DNA 扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定 DNA 序列进行定量分析的方法。·
Real-timePCR 是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
原理
所谓实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
检测方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
SYBR 定量 PCR 扩增荧光曲线图
PCR 产物熔解曲线图（单一峰图表明 PCR 扩增产物的单一性）
2.TaqMan 探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成完全同步。
服务流程
1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；
2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；
3.设计合成定量 PCR 引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；
4.DNA/RNA 的抽提、定量、RNA 反转录；
5.PCR 预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；
6.正式定量实验：对所有样品上机检测；
7.实验结果和数据分析，形成报告。
收费标准
优惠包干价：120 元/样/基因（SYBRgreenI 法，相对定量）
（含 RNA 提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3 个重复）；一个内参免费（内参 3 个重复）
技术原理
将标记有荧光素的 Taqman 探针与模板 DNA 混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板 DNA 互补配对的 Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得 Ct 值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
Ct 值
Ct 值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数
图 1
（如图 1 所示）。
1. 荧光阈值（threshold）的设定
PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct 值与起始模板的关系
每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n 为扩增反应的循环次数，X0 为初始模板量，Ex 为扩增效率，N 为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct 值。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光化学物质
实时荧光定量 PCR 所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan 荧光探针：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2. SYBR 荧光染料：在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料非特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。SYBR 仅与双链 DNA 进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定 PCR 反应是否特异。
3. 分子信标：是一种在 5 和 3 末端自身形成一个 8 个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR 产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定 DNA 序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
传统定量 PCR
1．传统定量 PCR方法简介
1）内参照法：在不同的 PCR 反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在 PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化 PCR 产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA 法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的 PCR－ELISA 法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即 PCR 到达平台期后进行检测，而 PCR 经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在 96 孔 PCR 仪上做 96 次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．内标对定量 PCR 的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重 PCR，双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
实时荧光定量 PCR
实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量 PCR 无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct 值的重现性 PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。
2）Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量 PCR 是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
实时荧光定量 PCR 的定量方法
在 Real-timePCR 中，模板定量有两种策略，相对定量和绝对定量。
相关应用
临床疾病诊断
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
动物疾病检测
禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。
食品安全
食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。
科学研究
医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
应用行业
各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
由于 qPCR 是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。
关于名称
根据 MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指导方针，qPCR 为 Quantitative real-time PCR 的简称，RT-qPCR 指的是 Reverse transcription–qPCR，RT-PCR 仅用来表示 Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是 Real-time PCR，但是有少数作者并没有坚持这一原则。
